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甲型流感病毒H16N5亞型雙重探針法qRT-PCR檢測及分型試劑盒
產(chǎn)品及特點
甲型流感病毒(Influenza A Virus)是常見流感病毒(簡稱禽流感)，甲型流感病毒某些亞型，如H16N5亞型，可以引起急性呼吸道傳染病，即甲型流感，其癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高。此病可通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結(jié)膜等多種途徑傳播，嚴(yán)重威脅人類健康，因此快速檢測甲型流感H16N5亞型具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測甲型流感H16N5亞型的試劑盒,它具有下列特點：
產(chǎn)品及特點
甲型流感病毒(Influenza A Virus)是常見流感病毒(簡稱禽流感)，甲型流感病毒某些亞型，如H16N5亞型，可以引起急性呼吸道傳染病，即甲型流感，其癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高。此病可通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結(jié)膜等多種途徑傳播，嚴(yán)重威脅人類健康，因此快速檢測甲型流感H16N5亞型具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測甲型流感H16N5亞型的試劑盒,它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對照和內(nèi)參，便于排除假陰性結(jié)果。
4. 特異性高，引物是根據(jù)甲型流感H16N5病毒RNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5各數(shù)量級。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法qRT-PCR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針法qRT-PCR緩沖液 |
500μL |
0.5mL藍(lán)蓋管 |
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探針法qRT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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H16N5亞型qRT-PCR引物-探針干粉（含內(nèi)參探針 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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H16亞型qRT-PCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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N5亞型qRT-PCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5 mL白蓋管 |
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人基因組DNA內(nèi)參陽性對照(1×10E4拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL橙蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用十一孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入216uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋含內(nèi)參的H16標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，是否做H16標(biāo)曲由客戶決定
稀釋含內(nèi)參的H16標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，是否做H16標(biāo)曲由客戶決定
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為A6，A5，A4，A3，A2，A1，A0。
2. 在A0號管中加入280μL熒光PCR專用模板稀釋液，35μL本試劑盒提供的人基因組DNA內(nèi)參（35000拷貝），震蕩一分鐘混勻。內(nèi)參濃度為1111拷貝/μL。
3. 用帶芯槍頭分別將上步得到的混合液按45μL/管加入到標(biāo)記的A1-A6號管中，用帶芯槍頭（下同）。
4. 在A6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的H16陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的H16標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，內(nèi)參濃度為1000拷貝/μL。放冰上待用。
5. 換槍頭，在A5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的H16標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，內(nèi)參濃度為1000拷貝/μL。放冰上待用。
6. 換槍頭，在A4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的H16標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，內(nèi)參濃度為1000拷貝/μL。放冰上待用。
稀釋含內(nèi)參的N5標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，是否做N5標(biāo)曲由客戶決定
7. 操作同上，只是使用N5的PC作為模板。得到6個濃度的樣本放冰上待用，內(nèi)參濃度均為1000拷貝/μL，分別是B1-B6。
樣品RNA的制備
8. 用自選方法純化N個樣品的RNA。由于本試劑盒的這個版本只提供DNA作為內(nèi)參，因此不能監(jiān)控純化過程。
Probe qRT-PCR反應(yīng)本試劑提供的內(nèi)參為DNA，只能監(jiān)控PCR過程
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+1+6+6個RT-PCR管，其中N個管用于上步得到的N個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于H16的標(biāo)準(zhǔn)曲線，另外6個用于N5的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3個RT-PCR管，其中N個管用于上步得到的N個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于H16 RT-PCR陽性對照，1個用于N5 RT-PCR陽性對照（直接用第一步和第二步所得的兩個4號稀釋液作為模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴(kuò)增陽性對照結(jié)果為陰性，則整個擴(kuò)增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對照為陽性，說明環(huán)境污染，則整個擴(kuò)增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購買新的引物和探針。
2. 如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 對定量檢測，以標(biāo)曲樣本濃度的log值為橫軸，分別以H16陽性對照（FAM通道）和N5陽性對照（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2必須大于0.95。再以待測樣品的Ct值從分別從兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出對應(yīng)樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 對定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽性對照FAM通道的熒光信號必須有對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對待測樣品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40則為H16陰性，如果小于或等于35則為H16陽性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40則為N5陰性，如果小于或等于35則為N5陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
5. 對H16或N5陰性樣本，如果內(nèi)參為陽性（Texas Red熒光通道有信號，信號有對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35），則判斷為真陰性。如果內(nèi)參為陰性（TET熒光通道沒有信號，信號沒有對數(shù)增長，沒有典型擴(kuò)增曲線，Ct值大于35），則不能判斷，本樣本需要重復(fù)。對H16或N5陽性樣本，不需要分析內(nèi)參的結(jié)果。
自備試劑
樣品RNA
樣品RNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
